Perikanan

 Kloning DNA

 Kloning DNA

 Kemampuan molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel disebut kloning DNA.  Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector.  Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong dengan DNA lain.  Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat diperbanyak pada organisme inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar.

 Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

 Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.

  1. Kloning DNA dalam plasmid vektor

 DNa dipotong dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak.  Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah bakteri E. coli. Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu:

  1. Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA   bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.
  2. Mengandung marker selektif yang menyebabkan sel yang membawa vektor (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi.
  3. Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi.  Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector  sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.

Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid.  Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri.  Pada banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika.

Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah.  Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI.  Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar 1).

  1. Vektor dapat dimasukkan ke organism inang melalui transformasi

 Transformasi merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari lingkungan.  Beberapa bakteri, tetapi bukan E. coli dapat mengambil DNA secara alami dan dikatakan memiliki kompetensi genetik.  E. coli dapat bersifat kompeten mengambil DNA melalui perlakuan dengan ion kalsium.   Antibiotika kemudian ditambahkan dalam medium untuk menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid – sell ini disebut transforman. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada medium, sedang yang tidak membawa plasmid, tidak dapat tumbuh (Gambar 7).

  1. Perpustakaan molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning

 Perpustakaan DNA merupakan populasi vector identik yang masing-masing berisi insert yang berbeda.  Untuk membuat perpustakaan DNA, DNA target dipotong dengan enzim restriksi yang memberikan ukuran rata-rata insert yang diinginkan.  Ukuran insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih dari satu megabase.  DNA yang telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang dipotong dengan enzim restriksi yang sama) dan ditambah ligase.  Hal ini menghasilkan koleksi vector dengan insert DNA yang berbeda (Gambar 2).

Berbagai perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari berbagai sumber.  Perpustakaan DNA yang paling sederhana dihasilkan dari DNA genomik total yang disebut dengan ‘genomic libraries’.‘cDNA library’ dikembangkan untuk memperkaya ‘coding sequences’ dalam library.  cDNA library dibuat dengan menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA.  Proses ini disebut reverse transcription yang dilakukan oleh enzim reverse transcriptase (Gambar 9).  Saat diberi perlakuan dengan reverse transcriptase, mRNA dikonversi menjadi kopi DNA utas ganda  yang disebut cDNA (copy DNA).

 Selanjutnya, proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada DNA genomic.  cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi yang sama dan fragmen-fragmen hasilnya disambungkan ke dalam vektor.

  1. Hibridisasi digunakan untuk mengidentifikasi klon spesifik dari sebuah library

 Identifikasi fragmen dari sebuah gen di antara klon-kon dapat dilakukan dengan menggunakan DNA probe yang urutan DNAnya sesuai dengan sebagian dari urutan DNA gen yang diinginkan.  Proses penggunaan probe dengan DNA yang dilabel digunakan untuk melakukan screening terhadap library disebut colony hybridization. cDNA library akan memiliki ribuan insert yang berbeda dan masing-masing terdapat dalam vektot umum.  Setelah transformasi ke dalam bakteri khusus yang cocok sebagai inang, sel ditumbuhkan dalam cawan petri dalam media agar.  Tiap sel akan tumbuh menjadi koloni dan tiap sel dalam koloni mengandung vector yang sama dan insert dari library, membrane filter dengan positive charge digunakan untuk probing.

sumber :

https://imii.co.id/compass-pro-apk/